Maîtrise de Biologie cellulaire

UNIVERSITE AIX-MARSEILLE II

FACULTE DES SCIENCES DE LUMINY

Sujet de TER :

Les ARNs d’interférence

Magali Liénart

ANNEE 2002-2003

Rapport effectué sous la direction de Juan Iovanna à l’EMI0116 de l’INSERM « stress cellulaire »

Centre de recherche INSERM, EMI0116, Parc Scientifique et Technologique de Luminy

Case915, Cedex9, 13288 Marseille France

Tél : 04 91 82 75 38

Fax : 04 91 82 60 83

Email : magalilienart@aol.fr

INTRODUCTION

Après la découverte des propriétés régénératrices des cellules souches embryonnaires et adultes ainsi que de certaines de leurs nombreuses applications thérapeutiques possibles, on découvre aujourd’hui l’existence d’un mécanisme qui vient bouleverser les sciences de la vie. Ce mécanisme universel gouvernant le vivant et sa reproduction, très conservé au cours de l’évolution, et pourtant jusqu’alors ignoré, est baptisé « ARNs interférents » par les scientifiques. Il permet d’induire une résistance aux acides nucléiques de pathogènes endogènes ou exogènes, en réponse à l’introduction d’ARNs double brin dans la cellule (transposons, transgènes ou virus), par la « mise en veille » de certains gènes responsables du déclenchement de graves maladies. La compréhension et la maîtrise de ce mécanisme ouvrent des perspectives aussi immenses qu’imprévisibles en ce qui concerne les génomes végétaux, animaux et humains. On commence seulement à explorer les processus moléculaires responsables du phénomène et à apprécier les espoirs qu’ils portent. En effet, bien qu’il soit encore trop tôt pour mesurer la portée exacte de cette découverte, la communauté scientifique est persuadée qu’elle ouvre des perspectives thérapeutiques nouvelles. Ces perspectives viennent prolonger et amplifier celles déjà entrevues par le séquençage du génome de l’espèce humaine. Des études génétiques ont même étendu son action probable à l’inhibition de la traduction au cours du développement, au remodelage de la chromatine, et à la méthylation des ADNs. Cela lui confère un rôle de régulateur de l’expression des gènes. Cette étude va permettre de se remémorer les conditions dans lesquelles le phénomène a été découvert, puis de détailler son mécanisme et enfin d’en déterminer la portée thérapeutique et l’impact de cette découverte dans le monde de la biologie. Cela se fera notamment à partir de l’étude d’un exemple de pratique thérapeutique en cours de développement, faisant intervenir son mécanisme dans la lutte contre l’infection par le HIV chez les mammifères.

I DECOUVERTE DU

PHENOMENE

En 1990, alors que le professeur Richard Jorgensen tentait de rendre la couleur pourpre de pétunias encore plus intense, en injectant le gène responsable de la coloration, des fleurs blanches apparurent : l’introduction d’un transgène exogène dont la fonction était déjà réalisée par un gène du pétunia a inhibé le processus de coloration. Le phénomène fut nommé co-suppression car non seulement le transgène est devenu inactif mais le gène endogène a lui aussi été modifié. La co-suppression concerne aussi des unicellulaires comme Neurospora crassa. D’autres chercheurs montrèrent que les plantes étaient capables de résister à l’injection d’ARN viral en le dégradant spécifiquement selon un processus apparemment voisin de celui réalisé pour le phénomène de co-suppression. Parallèlement, d’autres biologistes découvraient que l’injection d’ARNds (ARN double brin) pouvait bloquer l’expression de certains gènes et les rendre « silencieux », chez le ver C.elegans : ce phénomène prit le nom « d’interférence de l’ARN » ou «ARNi ». On montra par la suite que ce dernier se produit également chez la Drosophile, et même chez les mammifères. Au cours des années qui ont suivi la découverte de l’interférence de l’ARN, on a compris que le mécanisme était ancien. C’est le plus vieux et le plus ubiquitaire des systèmes antiviraux, apparu avant la divergence végétal-animal. Puis au cours de l’évolution il y a eu apparition de variations par rapport au mécanisme ancestral, à l’origine de phénomènes tel que la co-suppression ou la résistance aux ARNs antiviraux. Les organismes ont vu leur capacité à réaliser de telles fonctions évoluer indépendamment pour leur permettre une meilleure adaptation à leurs besoins et leur environnement. Mais tous ces phénomènes découverts indépendamment les uns des autres conservent cependant les bases d’un mécanisme commun, responsable de l’extinction de gènes particuliers par introduction d’ARNds. Quel est ce mécanisme ?

II MECANISME

Le phénomène d’interférence de l’ARN suit un mécanisme encore assez mal connu. Néanmoins, ses principales étapes ont été modélisées. Nous abordons d’abord la description globale de ce mécanisme, puis dans un deuxième temps, nous détaillons les relations structure-fonction de quelques enzymes intervenant au cours du phénomène.

II-1 Les différentes étapes du mécanisme

Le phénomène d’interférence de l’ARN suit un mécanisme encore assez mal connu. Il peut être déclenché par l’introduction dans la cellule de transgène monocopie fortement exprimé ou transgène moins fortement exprimé, mais en multicopie dans le génome, d’ARNs viraux ou réplicons de virus dont les gènes endogènes ont été intégrés par recombinaison homologue, et donc aussi de transposons.

Quelle que soit son origine, l’ARN se retrouve sous forme d’ARN double brin (ARNds) dans la cellule, pour permettre l’initiation du mécanisme (figure 1). Le mécanisme commence par le clivage de l’ARNds par la RNase Dicer, en présence d’ATP, pour produire des ARNs double brin de 21 à 25 nucléotides, appelés small interfering RNAs, ou ARNsi. Les caractéristiques de Dicer permettent d’obtenir des ARNsi portant deux nucléotides de plus à l’extrémité 3’ et un phosphate en 5’, maintenu par une kinase spécifique. Cette forme caractéristique de l’ARNsi lui permet de rejoindre un complexe nucléase effecteur RISC qui, une fois activé par déroulement de l’ARNsi grâce à l’hydrolyse d’ATP, guide l’ensemble vers les substrats homologues. L’ARNsi, toujours dans le complexe RISC mais cette fois sous forme simple brin, peut induire le clivage par RISC en un site spécifique de l’ARNm cible, ce qui conduit à sa dégradation (figure 1, voie 1). Cette première étape dans la mise en veille des gènes par l’interférence de l’ARN est distincte de l’étape d’amplification impliquant la polymérase RdRP (voie 2), mais les deux étapes sont nécessaires pour la mise en œuvre du phénomène.

Figure 1 : les différentes étapes du mécanisme d’interférence de l’ARN.

Pour l’étape d’amplification impliquant la polymérase RdRP (figure 1, voie 2 et figure 2), l’extrémité 3’OH de l’ARNsi issue du clivage de l’ARNds par RISC est essentielle: le brin anti-sens de l’ARNsi s’hybride à l’ARNm cible et sert d’amorce pour la réaction réalisée par RdRP. Cet ARNds synthétisé par RdRP est soumis à un nouveau cycle de digestion par Dicer pour produire des ARNsi secondaires en plus grande quantité. Une fraction des nouveaux ARNsi synthétisés sont alors déroulés par une hélicase, et cette fois les deux brins (sens et anti-sens) peuvent servir d’amorces pour le cycle de RdRP suivant. Cela conduit à une amplification de type exponentiel qui permet une augmentation de l’efficacité du phénomène. Ainsi les nouveaux ARNds synthétisés subissent une élongation en amont de l’ARNds d’origine : on parle du phénomène de transitivité de l’ARN d’interférence, responsable de l’extinction de l’expression de différents gènes ayant leur séquence en amont de la région cible initiale. De plus, ces ARNsi peuvent être transmis aux générations suivantes, ce qui permet de perpétuer le phénomène de cellules mères en cellules filles.

Figure 2 : les étapes d’amplification dans le mécanisme d’interférence de l’ARN.

II-2 Quelques enzymes impliquées dans le mécanisme

II-2-a Dicer

La structure (figure 3) des RNases III-like enzyme comme Dicer comporte :

-en C-terminal un ARNds binding motif (dsRBD)

-avec deux motifs de la catalyse de la RNase III en tandem (R IIIa et R IIIb)

-en N-terminal une longue extension dont la séquence prédit une activité ARN hélicase avec dans le domaine hélicase un motif ATP-binding site et une boite DECH

-et un domaine PAZ (Piwi / Argonaute / Zwille)

Figure 3: la structure de l’enzyme Dicer.

L’enzyme Dicer produit deux classes de petits ARNs de fonctions distinctes :

- les ARNmi (micro RNAs) qui régulent la traduction des ARNm

- les ARNsi (small interfering RNAs) qui dirigent la destruction de l’ARN par le phénomène d’interférence de l’ARN

Dicer est une endonucléase qui clive uniquement les ARNds (figure 4), quelle que soit leur séquence, et la structure de l’ARNsi produit porte un phosphate à l’extrémité 5’ et deux nucléotides qui dépassent en 3’. Ces deux caractéristiques suggèrent que Dicer est un membre de la famille des RNases III, nucléases spécifiques des ARNds.

Il existe trois classes de RNases III, basées sur la structure de leurs domaines :

- les RNases III bactériennes portent un domaine catalytique simple et un domaine de liaison à l’ARNds. Elles fonctionnent comme une enzyme dimérique avec des domaines antiparallèles formant deux centres catalytiques, grâce à la contribution de chacun des monomères.

- Les RNases III de Drosha portent un domaine catalytique double

- Les RNases III de classe 3 portent un domaine catalytique double, des motifs hélicases, et motifs PAZ. Elles clivent donc les ARNds en ARNsi et initient les phénomènes d’interférence de l’ARN.

Dicer appartient aux RNases III de classe 3. Quand les motifs de Dicer s’alignent antiparallèlement sur l’ARNds, il y a production de quatre sites (1 et 2) actifs mais dont les deux centraux seraient inactifs ( 2) à cause de l’introduction de résidus dans le centre catalytique du deuxième domaine de Dicer, responsable de la différence par rapport à la séquence consensus des RNases III de classe1. Dicer porte alors deux domaines catalytiques (1), d’où le clivage des deux brins de l’ARNds, tous les 22 nucléotides d’intervalle. Les modifications dans Dicer par rapport à la séquence consensus entraînent une variation dans l’espace entre les centres catalytiques, ce qui explique la variation spécifique dans la longueur des ARNsi produits. Dicer clive l’ARNds préférentiellement à ses extrémités et facilite l’alignement de nouvelles enzymes dans la région interne du substrat. L’efficacité du clivage dépend de la longueur de l’ARNds. Dicer reste liée au produit du clivage, ce qui ralentit l’activité enzymatique.

Dicer ne nécessite pas de cation bivalent pour la liaison à l’ARNds substrat, mais en nécessite pour son activité de clivage. De plus, les ions Mg2+ stabilisent la dimérisation. La liaison à l’ARNds résiste à l’augmentation de la stringence ionique ( augmentation de KCl ), mais pas l’activité de clivage de Dicer ( Dicer devient inactif ).

Le clivage de l’ARNds ne nécessite pas d’ATP chez les Mammifères, mais pour la Drosophile et C.elegans, de l’ATP se lie au domaine ATPase/hélicase de Dicer. On a différentes hypothèses pour l’intérêt de l’hydrolyse de l’ATP:

- pour le déplacement de Dicer le long de l’ARNds et le déroulement local du substrat, deux étapes sans doute nécessaires à la réalisation du clivage de l’ARNds, bien que d’autres facteurs soient nécessaires pour l’activation du domaine ATPase-like de Dicer

- pour permettre le relargarge du produit par l’enzyme et pour son transfert à la nucléase RISC

- pour permettre un réarrangement structural de Dicer nécessaire pour la liaison et le clivage du substrat suivant

Ces deux dernières hypothèses expliqueraient que l’activité de Dicer soit plus lente pour les Mammifères.

Dicer semble être localisée dans le réticulum endoplasmique, au moins pour Dicer humaine, ce qui est avantageux pour la production d’ARNmi et d’ARNsi, mais aussi pour l’augmentation de spécificité de Dicer, qui lui permet de discriminer les ARNds devant rendre silencieux des gènes, de ceux essentiels pour la traduction et pour d’autres processus ARN-dépendants.

On pense donc que le phénomène d’interférence de l’ARN a lieu à l’interface réticulum endoplasmique-cytosol. D’autres indices ont conduit à penser cela, comme le fait que les ARNs pré-messagers résistent au phénomène d’interférence de l’ARN, et que l’enzyme RISC peut être associée à des ribosomes.